近日，中国计量大学基于肝癌的血清样本对比了美国Thermo Scientific公司的Top14高丰度蛋白去除试剂盒和皇家马德里中文官网血液低丰度蛋白富集试剂盒（DMB）去除血清蛋白质组高丰度的效果[1]。结果表明DMB处理后的蛋白鉴定量在对照样本和疾病样本中分别是Top14的2.6和3.7倍，且DMB处理后低丰度蛋白质的鉴定覆盖率更高。

图1：3 种血清蛋白质组样本制备方案的技术路线^[1]

研究思路和关键结果

1. 使用DMB、Top14两种血清样本前处理试剂盒以及Blank对照，完成3例健康人和3例肝癌患者的血清蛋白质组分析；

2. DMB处理组鉴定的蛋白质组和肽段数目最高且富集的低丰度蛋白数量更多；

3. DMB处理组鉴定的差异蛋白最多；

4. DMB处理组鉴定的蛋白质的GO和KEGG分析结果远比Top14处理组和 Blank组丰富；

5. DMB处理组筛选出6个特征蛋白，可作为肝癌筛查候选生物标志物。

研究结果

一、肝癌血清样本蛋白质和多肽的鉴定

该研究分别采用了DMB、Top14两种血清样本前处理试剂盒以及Blank对照，完成了3例健康人和3例肝癌患者的血清蛋白质组分析。在各样本中，Top14处理组蛋白质和肽段鉴定数目均高于Blank组，DMB处理组鉴定的蛋白质组和肽段数目最高（图2a）。在HC中，DMB处理组特征鉴定的蛋白质组数量是 Top14处理组的2.6倍，是Blank组的3.9倍；在HCC中，DMB处理组特征鉴定的蛋白质组数量是Top14处理组的3.7倍，是Blank组的6.2倍。此外，Top14处理组和Blank组鉴定蛋白质组的丰度信息相近，DMB处理组鉴定蛋白质组的丰度较低（图2d）。综合表明，DMB方案在富集血清样本中的低丰度蛋白质效果最佳。

图2：蛋白质和多肽的鉴定情况

二、3种血清样本前处理方案的稳定性评价

该研究分别基于Proteome Discoverer搜库和MaxQuant搜库结果统计蛋白鉴定稳定性和定量稳定性。在HC中，DMB处理组鉴定频率为2的蛋白质数目高于其他两组，比Top14处理组多鉴定43个（57.3%），比Blank组多鉴定68个（136%）；DMB处理组鉴定频率为3的蛋白质数目同样高于其他两组，比Top14处理组多鉴定69个（25.3%），比Blank组多鉴定143个（71.9%）（图3a）。在HCC中，DMB处理组鉴定频率高的蛋白质数目依然高于其他两组，增加幅度比在HC中大（图3b）。但是DMB处理组的稳定性相对较差，这与鉴定频率为2的蛋白质数目较多有密切关系（图3c,d）。

图3：3种血清样本前处理方案的稳定性评价

三、各方案特征鉴定蛋白质的GO和KEGG分析

使用clusterProfile分别对各组实验在HC和HCC中特征鉴定的蛋白质进行GO和KEGG分析。DMB处理组特征鉴定的蛋白质的GO和KEGG富集结果均最丰富，相对于Top14处理组和Blank组有显著变化（图4a），在KEGG富集结果中表现得最为明显。DMB处理组特征鉴定的蛋白质主要参与的信号通路有ECM-受体相互作用、白细胞跨内皮迁移和肌动蛋白细胞骨架的调节等。

图4：各方案特征鉴定蛋白质的GO和KEGG分析

四、健康人群和肝癌人群血清样本差异蛋白质组分析

该研究基于健康人群和肝癌人群的血清样本，比较了DMB和Top14血液样本前处理试剂盒相对于血清原液在蛋白质组差异分析中的优势。Blank组共获得17 个差异蛋白，Top14处理组共获得15个差异蛋白，DMB处理组共获得47个差异蛋白，在肝癌人群中表达上调的有41个，下调的有6个（图5a-e）。差异基因的PCA分析可以很好地区分健康人群和肝癌人群。3组实验的差异蛋白质组分析均可发现在肝癌血清样本中显著上调的基因，但在获得的差异基因数量上和所行使的功能上有所不同，这对于理解肝癌的发生发展分子机制有影响。

图5：Blank、Top14和DMB样本制备方案肝癌血清样本差异蛋白质组分析

五、基于DMB组差异基因的PPI分析

基于上述分析结果，相较于Blank组和Top14处理组，DMB处理组对血清中低丰度蛋白的鉴定效果有显著提升，特征鉴定蛋白的功能富集结果更加丰富，发现的差异表达基因数量明显增多。使用String对DMB组差异基因进行蛋白质互作网络（protein-protein interaction networks,PPI）分析。该网络图包含37个节点，其中HSP90AB1、SPP1、ACTR3、SNCA、PECAM1和SRC在健康人群和肝癌人群中表现出显著差异（图6b），可作为肝癌筛查候选生物标志物。

图6：基于DMB前处理方案在肝癌血清样本的差异蛋白质组分析

研究结论

本研究讨论了基于Top14和DMB血液样本前处理试剂盒相对于血清原液在蛋白质组分析中的优势，以及Top14和DMB2种试剂盒在蛋白质组分析中的优劣势。在肽段和蛋白质鉴定方面，DMB处理组蛋白质的鉴定数量远高于Top14 处理组和Blank组。DMB处理组对低丰度蛋白的鉴定有更好的结果。DMB特征鉴定的蛋白质的GO和KEGG分析结果远比Top14处理组和Blank组丰富，证明了DMB处理组鉴定蛋白质的多样性。

参考文献

[1]赵佳威,陆澳,赵洋等.血清蛋白质组高丰度蛋白去除方法比较研究[J/OL].质谱学报:1-12[2024-03-20].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20240318.1717.003.html.